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实验笔记丨CRISPR-dCas9实验步骤详解
1、载体酶切 准备灭菌的PCR离心管，配制酶切体系，放置PCR仪，孵育3小时，终止酶切后使用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。琼脂糖凝胶DNA回收 将吸附柱置于收集管中，加入Buffer BL，离心活化硅胶膜；在紫外灯下，用刀片切下目的条带，尽量去除非目的DNA，确保体积最小。
2、sgRNA长度：SpCas9一般为20nt。 sgRNA序列碱基组成：基因特异的sgRNA模板序列位于PAM序列前，PAM序列特征为NGG （N为任意核苷酸），选择3末端含有GG的sgRNA，可构成PAM序列。sgRNA序列应避免以4个以上的T结尾，GC含量最佳为30%-70%（40%-60%）。
3、面对新入侵序列，细菌需首先整合新序列到CRISPR系统，然后启动上述防御过程。新序列与PAM上游20个碱基配对，被切割并整合，形成新的间隔序列。PAM即Protospacer adjacent motif，识别NGG序列，也可以识别其他特定序列。CRISPR-Cas9剪切方式包括基因敲除、基因敲入和基因干扰。
4、Cas9 mRNA和gRNA的制备是关键步骤，通过体外转录和线性化Cas9载体，以及PCR和体外转录gRNA，确保产物质量。随后，将Cas9 mRNA和gRNA混合，通过显微注射技术导入小鼠受精卵，通过扩增和测序目标基因，鉴定基因编辑的成功。
5、前阵子才写道 ： CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 Month 4 --可能的收官之帖（但还远未结束） 说自己收官之作，哪里想到这么快就要继续开始新的实验了。
今年几月几号白露2023
年白露时间：9月8日05：26：31，星期五，农历七月廿四。白露代表天气渐渐转凉。白露是一个反映自然界气温变化的重要节令，基本结束了暑天的闷热，是秋季由闷热转向凉爽的转折点。古人以四时配五行，秋属金，金色白，故以白形容秋露。
年白露开始时间：9月8日05：26：31 2023年白露结束时间：9月23日14：49：46 2023年白露农历时间：七月廿四 2023年白露星期时间：周五 白露节气风俗白露酒 用糯米、高粱等五谷酿成，其酒温中含热，略带甜味，称“白露米酒”。白露茶 民间有“春茶苦，夏茶涩，要喝茶，秋白露”的说法。
年白露开始时间：9月8日05：26：31 2023年白露结束时间：9月23日14：49：46 2023年白露农历时间：七月廿四 2023年白露星期时间：周五 白露的含义白露是农历二十四节气之一，当太阳到达黄经一百六十五度时为白露节气。白露是秋天的第三个节气，表示孟秋时节的结束和仲秋时节的开始。
年白露开始时间：9月8日05：26：31 2023年白露结束时间：9月23日14：49：46 2023年白露农历时间：七月廿四 2023年白露星期时间：周五 白露代表的寓意天气转凉 白露，是“二十四节气”中的第十五个节气，干支历申月的结束与酉月的起始。斗指癸，太阳达黄经165度，于公历9月7—9日交节。
年白露时间：公历2023年9月8日5点26分31秒，农历七月廿四号，星期白露的含义是天气转凉，露凝而白。白露是“二十四节气”中的第十五个节气，秋天的第三个节气，表示孟秋时节的结束和仲秋时节的开始。寒生露凝，“白露”是反映自然界寒气增长的节气。
如何把淘宝的黑号变白号了?
申请复审或申诉 如果初次联系淘宝客服未能解决问题，我们可以考虑申请复审或申诉。复审是指通过淘宝平台上的相关功能重新提交账号审核申请，详细说明自己的情况，并提供必要的证据。申诉则是向淘宝官方进行正式投诉，通过填写申诉表格并附上相应证据来表达自己的冤屈。
方法一：对于目前还是白号，要好好珍惜，不要老是用这个号去下白菜单！多用余额宝和花呗支付，对号有利。已经是黑号，在有刚需大额订单的时候，用黑号下，争取变白号。在天猫会员页面有个购物行为评价，留意下星级变化，越高越好。不建议使用软件特容易被发现。
淘宝黑号变白的方法并不固定，因为淘宝的系统算法和规则随时在变化。但通常，要洗白一个淘宝黑号，用户需要改善自己在淘宝平台上的行为，提升信用度，并尝试与淘宝客服沟通解决问题。以下是一些建议性的步骤：首先，用户应该检查自己是否存在违规行为。
具体操作步骤如下：确认账号被黑，可以尝试用原密码登录，如果无法登录或遇到其他异常情况，就有可能是账号被黑客入侵了。修改密码，绑定手机和邮箱，关闭异常登录设备，安装杀毒软件。联系淘宝客服，他们将会协助你进一步确认账号被黑的情况，并提供相关的解决方案。
商家需要详细查看淘宝规定，找出可能触发黑号的违规行为，并进行整改。提供证明材料： 商家可以准备相关证明材料，如商品真实性证明、售后服务证明等，向淘宝客服提交，以证明自己的经营行为是合法的。与客服沟通： 主动与淘宝客服取得联系，说明整改情况，提供证明材料，并请客服协助尽快解封账号。
淘宝黑号了一年才能白回来。淘宝黑号转白号的方法其实挺简单的，就是不要参加或者违法活动，然后正常购物，一年之内就可以转白。淘宝黑号官方是没有具体规定的，如果想要恢复需要一系列操作，一般情况下黑号是无法进行恢复的。淘宝变成黑号后，无法领取优惠券，秒杀活动也无法参加，积分也会变得比较少。
几号白露2023
年白露开始时间：9月8日05：26：31 2023年白露结束时间：9月23日14：49：46 2023年白露农历时间：七月廿四 2023年白露星期时间：周五 白露节气风俗白露酒 用糯米、高粱等五谷酿成，其酒温中含热，略带甜味，称“白露米酒”。白露茶 民间有“春茶苦，夏茶涩，要喝茶，秋白露”的说法。
年白露开始时间：9月8日05：26：31 2023年白露结束时间：9月23日14：49：46 2023年白露农历时间：七月廿四 2023年白露星期时间：周五 白露节气的传统习俗收清露 中国民间在白露节气有“收清露”的习俗，明朝李时珍的《本草纲目》上记载：“秋露繁时，以盘收取，煎如饴，令人延年不饥。
年白露开始时间：9月8日05：26：31 2023年白露结束时间：9月23日14：49：46 2023年白露农历时间：七月廿四 2023年白露星期时间：周五 白露吃什么传统食物十样白 浙江温州等地有过白露节的习俗。
年白露开始时间：9月8日05：26：31 2023年白露结束时间：9月23日14：49：46 2023年白露农历时间：七月廿四 2023年白露星期时间：周五 白露的含义白露是农历二十四节气之一，当太阳到达黄经一百六十五度时为白露节气。白露是秋天的第三个节气，表示孟秋时节的结束和仲秋时节的开始。
年白露开始时间：9月8日 05：26：31 2023年白露结束时间：9月23日 14：49：46 2023年白露农历时间：七月廿四 2023年白露星期时间：周五 白露三候一候：鸿雁来 鸟从北向南飞，大曰鸿，小曰雁。鸿雁是一种大型的水鸟，主要是在河流、湖畔等地方活动。每年到了9月初就要开始迁徙。
年白露时间：9月8日05：26：31，星期五，农历七月廿四。白露代表天气渐渐转凉。白露是一个反映自然界气温变化的重要节令，基本结束了暑天的闷热，是秋季由闷热转向凉爽的转折点。古人以四时配五行，秋属金，金色白，故以白形容秋露。
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